Enzymoloog filmt dichtplakken gat in DNA

In slow motion laten zien hoe een breuk in een streng DNA gedicht wordt. Het lukte enzymoloog Alexey Cherepanov met behulp van vaste stof NMR. Deze week publiceert hij er, samen met Delftse en Leidse collega's, over in het wetenschappelijke toptijdschrift PNAS. Het is een opmaat naar 3D moleculaire films.

DNA-schade
Schade aan het DNA ontstaat door legio factoren: zonlicht, straling, giftige stoffen, infecties, of gewoon veroudering. Als er niet continu reparatiewerkzaamheden plaatsvonden zou het droevig gesteld zijn met ons erfelijk materiaal.

DNA-ligase
Breuken in het DNA worden weer dichtgemaakt door het enzym DNA-ligase. Bij deze operatie zijn twee andere ingrediënten essentieel: ATP en magnesium. ATP, dat vooral uit fosfor bestaat, is het stofje dat overal in het lichaam energie opneemt en weer in de gewenste vorm afgeeft. Magnesium is nodig om de reactie te laten beginnen.

Dr. Alexey Cherepanov: 'Het eerste waar je aan denkt zijn natuurlijk de mogelijke medische toepassingen. Als we snappen hoe DNA-ligase werkt kunnen we in de toekomst meer te weten komen over ziektes die te maken hebben met beschadigingen in het DNA. Maar de gevolgen zijn veel breder. Vijftig jaar geleden werd voor het eerst de structuur van een eiwit opgehelderd, met behulp van röntgenstralen. De chemicus Perutz en moleculair bioloog Kendrew hebben daar later de Nobelprijs voor gekregen. Toen wisten we dus hoe een eiwit eruit kan zien. Nu, 50 jaar later, beginnen we met het maken van moleculaire films, en gaan we leren hoe eiwitten werken.' Videotheek 'Je wilt weten waar we over tien jaar staan? Laten we zeggen twintig. Dan bestaat er een databank van moleculaire films van reacties met eiwitten, zoals er nu een databank van eiwitstructuren is. Nu hebben we een fotoalbum; over 20 jaar hebben we een videotheek. Op basis daarvan kunnen we algemene wetten maken over hoe ze werken, en vervolgens kunnen we onze eigen eiwitten maken. Bijvoorbeeld enzymen die water splitsen, zodat auto's op waterstof kunnen rijden. En stel je de blijdschap van de wasmiddelenfabrikanten maar voor.'

Film
De hele reactie voltrekt zich in een fractie van een seconde. Dr. Alexey Cherepanov bedacht een manier om dit supersnelle proces zelf in gang te zetten, en vervolgens de stappen ervan door koeling te vertragen en zelfs stil te leggen. Met behulp van een speciale toepassing van vaste stof NMR maakte hij een chemische film van het dichten van een breuk in het DNA van een eenvoudig virus. Door de temperatuur te variëren kan hij het proces op cruciale momenten stilzetten, om het vervolgens weer stapsgewijs verder te laten gaan. Met zijn werk heeft Cherepanov het proof of principle geleverd dat het maken van een 3D moleculaire film mogelijk is.

In de greep
Cherepanov: 'Je ziet de verschillende stadia van de reactie. Eerst zie je het magnesium binden. Dan zie je dat er een soort vijfbenig tussenstadium is. Dat is heel controversieel, want onderzoekers liggen altijd in de clinch of die stap er wel of niet is. Het is een prachtig gezicht. Als het DNA-ligase bindt met het ATP, zie je dat het dat letterlijk in een greep neemt, openmaakt om de energie vrij te laten komen, en het vervolgens weer uitspuwt. En we kunnen het energielandschap meten. Dat hebben we echt als allereersten gedaan.'

Bevriezen
Enzymen - alleen al in ons lichaam zijn er meer dan 3000 verschillende aan het werk - zijn veel te klein en werken veel te snel om ze met een microscoop te kunnen zien. Dus, zegt Cherepanov, kun je twee dingen doen: of je moet heel snel kunnen kijken, of je moet ze bevriezen.

Cryogeen
Het eerste kan hij niet, dus hij koos voor het laatste. Bij zogenoemde cryogene temperaturen registreert zijn spectrometer alle fasen van het reparatieproces. 'We beginnen bij -33 graden Celsius. Om de details te kunnen bekijken, en van de opeenvolgende plaatjes een film te kunnen maken, leggen we de zaak stil bij -100˚ Celsius. Als je de temperatuur weer laat stijgen wordt de reactie hervat.'

Energie meten
Cherepanov werkt met vaste stof NMR spectroscopie. NMR staat voor nucleaire magnetische resonantie. Een van de grote voordelen daarvan, boven bijvoorbeeld het gebruik van röntgenstralen, is dat het de moleculen intact laat. NMR maakt gebruik van het feit dat atomen als magneetjes werken. De richting daarvan kun je met radiogolven laten omklappen, en de energie van dat omslaan kun je meten. Die energie is afhankelijk van de unieke chemische omgeving van het molecuul in actie.

Cherepanov voor de spectrometer in het vaste stof NMR lab.

Magic Angle Spinning
Bij vaste stof NMR wordt een sample niet in een vloeistof opgelost. Handig voor moleculen die niet in water oplosbaar zijn, of als je tot diep onder nul wilt koelen.

Om mooie scherpe energiepieken te kunnen meten, werd het vaste sample met een snelheid van duizenden omwentelingen per seconde rondgedraaid, in een zeer sterk magnetisch veld. Uren en zelfs dagen lang tolde het rond in de ijskoude spectrometer, om het gedrag een enzym in actie in detail te volgen.

Magnesium vrijlaten
Maar met de combinatie van NMR, magic angle spinning en het vertragen en stilleggen van de reactie ben je er nog niet. De chemische reactie zelf moet ook nog eens precies beginnen op het moment dat jij dat wilt. Cherepanov: 'In het echt duurt zo'n reactie een fractie van een seconde. Jij moet dus nog sneller zijn, want voor je het weet is hij alweer voorbij'. Hij werkt aan twee methoden om dit voor elkaar te krijgen. Een daarvan is het onderwerp van zijn PNAS-artikel. De clou daarbij is om precies op het juiste moment magnesium vrij te laten komen om de reactie in gang te zetten. Hiervoor bedacht hij een truc.

Pakje
Cherepanov pakt het magnesium eerst in in een verbinding. 'Dat noemen we een caged compound.' Dan brengt hij het DNA-ligase en de energieleverancier ATP bij elkaar. Die binden aan elkaar, maar een reactie blijft vooralsnog uit, omdat er geen magnesium aanwezig is. Vervolgens wordt het pakje met magnesium toegevoegd, maar nog steeds niet opengemaakt.

Het dichtplakken van een gat in DNA De bovenkant van de karakteristieke dubbele helix structuur van DNA, met de breuk. Van bovenaf nadert het ATP molecuul, dat vast zit aan het enzym DNA-ligase. Het magnesium is dan al vrijgemaakt uit de lichtgevoelige verpakking, om de reactie te laten beginnen. In het midden de tussenstap die de onderzoekers ontdekten. Eén verbinding op weg naar reparatie van het DNA is al gelegd, maar de andere is nog niet verbroken.   Hier is te zien hoe het enzym het gat dicht, en daarmee het DNA repareert, gebruikmakend van de energie van het ATP. Het chemische mechanisme van dit proces was controversieel, en is nu voor het eerst gefilmd en in kaart gebracht met hoge resolutie vaste stof NMR.

Openbreken met licht
Pas als de spectrometer gekoeld en wel in gereedheid is gebracht om te gaan meten, laat Cherepanov het magnesium los. Dat doet hij met behulp van licht: 'De verbinding is lichtgevoelig. Door er licht op te schijnen breek ik hem open, zodat het magnesium vrijkomt. Dat bindt aan de DNA-ligase, en zet de reactie in gang. En dan kunnen we gaan kijken.'

Moleculaire films
Toch is dit pas de eerste stap, zegt Cherepanov. 'Dit is een chemische film, die laat zien hoe chemische verbindingen tot stand komen en weer loslaten. Nu willen we ook alle atomen van het eiwit daaromheen gaan bekijken. Dan pas kunnen we echte 3D moleculaire films gaan maken. Dat wordt voor mij echt nog wel een jaar of vijf taaie arbeid, met veel praktische en technische hobbels. Ook ben ik met de TU Delft nog met een andere methode bezig om de reactie te laten beginnen, waarbij je dat ingepakte magnesium niet nodig hebt, namelijk met behulp van een razendsnelle microscopische mixer, de aller-snelste ter wereld. Dat wordt het eerstvolgende artikel!'

Alexey Cherepanov won in 2004 een Veni-beurs om dit onderzoek te doen. Hij studeerde chemie in Novosibirsk en aan het Moskouse Instituut voor Fysica en Technologie. Daar werkte hij aan HIV, een RNA-virus. Hij promoveerde in Delft op DNA-ligase, was daar postdoc om zich te bekwamen in zijn speciale methode van invriezen, en zette vervolgens zijn onderzoek voort in de vaste stof NMR groep van prof.dr. Huub de Groot van het Leiden Institute of Chemistry, volgens Cherepanov een van de top four vaste stof NMR specialisten ter wereld. Ingenieuze toepassingen van magic angle spinning vormen een van zijn specialismen.

-----

The associative nature of adenylyl transfer catalysed by T4 DNA ligase,

Alexey V. Cherepanov, Elena Doroshenko, Jörg Matysik, Simon de Vries, Huub J.M. de Groot.

PNAS Early Online Edition 18 juni 2008.

 

(10 juni 2008/HP)